一般認為，地表海平面空氣中，氮（78.08 Vol.-%：單位體積的混合氣體中該氣體體積所占的百分比，習(xí)慣上稱作氣體百分含量或氣體濃度，下同）、氧（20.95%）和二氧化碳（0.04%）這幾種氣體的相對含量，寰宇之內(nèi)皆保持穩(wěn)定。因此，當人們習(xí)慣以N₂：O₂：CO₂ = 0.78 %: 0.21% : 0.0%來描述實驗工作條件并由此推而廣之時，就很容易認同這樣的概念：不管是在德國馬克斯-普朗克研究所（Max Planck Institute, MPI）, 哈佛醫(yī)學(xué)院（Harvard Medical School，HMS），還是北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，所有在地面細胞間內(nèi)開展的“常氧normoxia”細胞培養(yǎng)實驗，CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)部的氣體環(huán)境條件是一致的。

       而大量研究報告卻表明，地表空氣中這三種與細胞培養(yǎng)密切相關(guān)氣體組分的相對含量絕非固定不變。相反，這三種氣體的相對比例會隨著地表海拔高度、氣象要素、地表植被覆蓋和所在地區(qū)工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動中氣體排放條件不同而變化。其中O₂、CO₂這兩種氣體百分含量之波動尤其明顯。資料顯示，僅西藏一省之內(nèi)，從東部溫帶森林—草原—草甸區(qū)域到西部寒帶溫帶草原—荒漠—草甸區(qū)域，在一年之內(nèi)不同季節(jié)，地表年均O₂體積百分含量可在19.91% - 20.93區(qū)間波動。我國幅員遼闊，不同地域地表空氣中O₂相對含量波動幅度要超出這一區(qū)間。

       我國《缺氧危險作業(yè)安全規(guī)程GB8958-2006》規(guī)定，當特定環(huán)境的空氣中O₂的百分含量低于19.5%，則該工作場所應(yīng)被視作缺氧場所而而需對其間進行的各種作業(yè)加以監(jiān)管。因各種原因造成細胞培養(yǎng)間內(nèi)空氣中O₂的含量低于此標準時，則細胞也會因此而從“常氧”氛圍悄然落入“缺氧”的險境。

       氧氣曾被認為只在新陳代謝中發(fā)揮作用，不影響基因表達。而威廉?凱林（William G. Kaelin Jr）、彼得·拉特克里夫爵士（Sir Peter J. Ratcliffe）和格雷格?塞門扎（Gregg L. Semenza）三位2019年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎獲得者的發(fā)現(xiàn)表明，由紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factors， HIF)組成的氧氣感知通路與調(diào)節(jié)機制，使細胞能夠通過調(diào)節(jié)基因表達來適應(yīng)生理環(huán)境中O2含量的波動。                                              

       需氧生物細胞需要O₂供給才能通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP。O₂可利用性幾乎影響所有生物學(xué)過程，包括激活多種適應(yīng)性生理反應(yīng)、影響能量代謝、氧化還原平衡、血管重塑等過程。因此，有效調(diào)控實驗環(huán)境中的O₂含量水平，對模擬人和哺乳動物細胞的生理環(huán)境和功能活動狀態(tài)具有重要意義。實際工作中，采用參考文獻報道的HEK293細胞株、相同的Heracell VIOS 160i或CellXpert C170i 培養(yǎng)箱，以相同的工作條件并培養(yǎng)相同時間，有可能依然不能重現(xiàn)文獻中的實驗結(jié)果，這種情形并不罕見。究其個中緣由，除了實驗設(shè)備工作性能差異因素，不同實驗地點室內(nèi)空氣中O₂含量可能存在的差異對細胞狀態(tài)的干擾，未嘗不是一種合理的解釋。

一、細胞培養(yǎng)實驗對O₂控制的內(nèi)在需求

       眾所周知，常規(guī)CO₂培養(yǎng)箱標準配置中因缺少O2傳感器，一般只能實時監(jiān)測箱體內(nèi)部的CO2氣體體積百分濃度、氣體溫度。而細胞培養(yǎng)過程中O₂濃度則處于“裸奔”狀態(tài)。

       科學(xué)家已習(xí)慣于用CO₂培養(yǎng)箱進行細胞培養(yǎng)，并默認箱內(nèi)的O₂含量處于“天然的正常”的“常氧(normoxia)”水平（譬如某地的O₂體積百分含量為20.86%)。其實，所謂的“常氧”是一個只可意會不可言傳的“暗箱”規(guī)定，并非放之四海而皆準。不同細胞培養(yǎng)環(huán)境下O₂含量的差異被視為可接受的實驗條件誤差，不僅不會被深究，而且業(yè)界還約定成俗地將其刻意忽略。但如有某君“與眾不同”在公開的實驗報告中將細胞培養(yǎng)實驗條件用了“cells were cultured at 37℃, and atmosphere with 20.86% O₂ and 5% CO₂)”這樣的描述，不僅會讓人難以理解 “20.86% O₂”這一工作參數(shù)依據(jù)來源，甚至還會因披露此參數(shù)，讓同行而對該實驗數(shù)據(jù)與結(jié)論的可靠性產(chǎn)生疑慮。依托常規(guī)CO₂培養(yǎng)箱進行的細胞實驗中，對氧含量問題的態(tài)度就是：你不用說，我也不會問你。

       即便沒有細胞對氧氣含量改變時發(fā)生自適應(yīng)機制這一諾獎級研究，氧含量不同對細胞生理病理活動產(chǎn)生影響，在科學(xué)界也早有共識。雖然人類和動物的生命活動、組織細胞的培養(yǎng)實驗都在“常氧”條件下進行的，但人體內(nèi)部眾多組織器官的微環(huán)境中的生理性氧濃度要遠低于“常氧”水平，處于“生理性低氧”（physiological hypoxia）狀態(tài)。

表1 人體內(nèi)的生理性低氧組織列舉

       目前已知，小鼠胚胎成纖維細胞（Mouse Embryonic Fibroblasts, MEF)等多種原代細胞、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML) 細胞等腫瘤細胞、間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)等在較低氧濃度下培養(yǎng)會比在“常氧”條件下成長，能更好地模仿正常生理條件，其細胞行為也更能反映體內(nèi)環(huán)境的變化。如神經(jīng)元細胞在2-5%的 O₂水平下存活率、增殖和多巴胺能分化增加。人胚胎干細胞(Human Embryonic Stem Cells, hESCs)或誘導(dǎo)性多能干細胞（induced Pluripotent stem cell，iPSC）在低氧培養(yǎng)環(huán)境下，可減少細胞自發(fā)性分化、提高克隆形成率、降低自發(fā)性染色體異常頻率以及增加特定克隆衍生細胞的增殖。研究人員藉由低氧培養(yǎng)環(huán)境控制還可模擬腫瘤內(nèi)部核心細胞或稱作癌癥干細胞(Tumor Stem Cell)生長狀況。

       文獻報道中，“低氧hypoxia”的標準按O₂相對含量不同，還有生理含量氧（physioxic，5%-15% O₂ Vol.-%)、低氧（hypoxic，1% O₂ Vol.-%) 和無氧（anoxic，0% O₂ Vol.-%)的不同提法。業(yè)內(nèi)則習(xí)慣于將應(yīng)用環(huán)境中O₂百分比含量19%以內(nèi)情形統(tǒng)一歸入低氧范疇。

       要將細胞培養(yǎng)過程的O₂體積百分含量之維持在低氧水平，就須實時監(jiān)測細胞CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)氣體中的O₂濃度實際值，并使之持續(xù)穩(wěn)定地維持在所設(shè)定水平。多氣體二氧化碳培養(yǎng)箱正是在這種科學(xué)實踐需求環(huán)境下應(yīng)運而生。

       常規(guī)CO₂培養(yǎng)箱運行需要空氣（其中的O₂作為細胞呼吸鏈中活性氧離子的來源）和CO₂（醫(yī)用氣體純度≥99.0%，用作培養(yǎng)基緩沖體系HCO₃-組分補充來源）供應(yīng)。空氣中O₂含量因已達到“常氧”標準，故不作要求，無需監(jiān)測。通常只配置CO₂傳感器，并將CO₂濃度維持在5%的水平即可滿足基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)要求。

       多氣體二氧化碳培養(yǎng)箱，習(xí)稱多氣體培養(yǎng)箱（Multi-gas incubator），不僅要監(jiān)控O₂濃度并使之維持穩(wěn)定，還須在此基礎(chǔ)上加裝O₂控制單元?？豋₂單元核心主要包括箱體內(nèi)部的氧化鋯傳感器（Zirconium dioxide, ZrO₂）及O₂氣控制回路、箱體外部O₂/N₂通用輸入接口及連接氣路。當空氣中O₂濃度低于(22-90%)設(shè)定值時（高氧培養(yǎng)實驗），向箱內(nèi)輸入高純度O₂（醫(yī)用氧氣純度≥99.5%）。當進行1% - 18%濃度的低氧培養(yǎng)實驗時，需輸入對哺乳動物細胞惰性無害且易于大規(guī)模制備、成本相對低廉的高純度N₂（醫(yī)用氮氣純度≥99.99%），以稀釋箱內(nèi)空氣的O₂濃度?？梢?，無論是高氧還是低氧細胞培養(yǎng)，多氣體培養(yǎng)箱在工作時都離不開空氣、CO₂氣體和N₂（低氧培養(yǎng)）或O₂（高氧培養(yǎng)）三種氣源。而“三氣培養(yǎng)箱(tri-gas incubator)”的名稱正是由此而來。

表2 主流進口品牌三氣培養(yǎng)箱的工作氣體輸入要求

       三氣培養(yǎng)箱雖衍生于CO₂培養(yǎng)箱，但用戶無法通過簡單升級而實現(xiàn)精確控氧功能，須在設(shè)備出廠前定制。

      不僅如此，表2所列的三氣培養(yǎng)箱型號中，除CellXpert C170i只有0.1 - 20%只有低氧控制一個配置選項外，其它品牌的同類產(chǎn)品，如Heracell VIOS 160i ，CB 170-230V-O和MCO-170M都提供有高、低兩種氧氣控制選項備選。

       從文獻報道上看，生物醫(yī)學(xué)實驗研究中，三氣培養(yǎng)箱多用于細胞的5%低氧模擬生理氧濃度培養(yǎng)和0-1% O₂的細胞缺氧（組織缺血缺氧）造模處理。 (后續(xù)：低氧細胞實驗中三氣培養(yǎng)箱氮氣使用有效管理問題的解決方案——中)