（前續(xù)：低氧細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中三氣培養(yǎng)箱氮?dú)馐褂糜行Ч芾韱栴}的解決方案——中 ）

三、低氧細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中三氣培養(yǎng)箱經(jīng)濟(jì)平穩(wěn)運(yùn)行的解決方案

       三氣培養(yǎng)箱本為O₂治理而生，而為此付出代價最大的卻是N2，還捎帶上了CO₂。兩種氣體各自消耗量還因O₂濃度設(shè)定值而異。如三氣培養(yǎng)為間歇性運(yùn)行，在O₂含量5%設(shè)置條件下，每次儀器重啟初始化進(jìn)程所消耗的CO₂氣體流量約為同等工作容積CO₂培養(yǎng)箱所消耗量的10.5倍。而低氧運(yùn)行維持期間，因這兩種氣體的消耗速度相差懸殊而氣瓶更換頻次不統(tǒng)一且隨O₂含量控制要求而變化。對設(shè)備管理者而言，多人共享三氣培養(yǎng)箱的情況下，要判斷N₂鋼瓶中余量液氮是否能有效應(yīng)對下一步低氧實(shí)驗(yàn)要求，需提前儲備多少氣瓶方可高枕無憂，這顯然極為困難。而實(shí)驗(yàn)者則需對兩種氣體，特別是N₂的“高消費(fèi)”開支做足思想準(zhǔn)備。

       既要確保低氧細(xì)胞實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中N₂穩(wěn)定供應(yīng)，又要有效降低實(shí)驗(yàn)中N₂消耗，這是眾多細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)者必須要面臨的問題。而三氣培養(yǎng)箱國外制造商為低氧實(shí)驗(yàn)的可靠實(shí)施，提供了多種類型與N₂管控有關(guān)的工作附件選項(xiàng)，的確具有重要實(shí)用價值。

3.1 氣瓶自動切換器

       氣瓶自動切換器（Gas tank changer）是一種能夠?yàn)闅馄繜o縫切換供氣而開發(fā)的簡便裝置。其功能設(shè)計(jì)類似于三通閥：有2個輸入端口和一個輸出端口。兩個輸入端口分別連接2個同種氣體的氣瓶（CO?、N?或 O?），可實(shí)時監(jiān)控供氣瓶的氣壓。輸出端口則可與一個或多個培養(yǎng)箱連接。

       當(dāng)?shù)谝粋€氣瓶中的氣體耗盡時，它將自動切換到第二個備用氣瓶供氣。當(dāng)備用氣瓶的氣體也將耗盡時，裝置會發(fā)出聲光報(bào)警提醒用戶更換氣瓶。三氣培養(yǎng)箱配置氣瓶自動切換器后，實(shí)驗(yàn)者無需在氣瓶處于低壓運(yùn)行期間時刻緊盯氣壓表和并隨時準(zhǔn)備更換氣瓶，即避免有效氣源的浪費(fèi)，更有利于實(shí)現(xiàn)N₂供氣管理的長治久安。

       氣瓶自動切換器分為外置（External gas guard）和內(nèi)置（Built-In Gas Guard）兩種。

       內(nèi)置自動切換器與主機(jī)電源和控制系統(tǒng)連接，為出廠預(yù)裝組件，需在訂購三氣培養(yǎng)箱時定制。

       外置自動切換器則可由專業(yè)人員在用戶現(xiàn)場安裝，不僅功能強(qiáng)悍，且布署十分靈活。裝置同時連接一主一副兩個氣瓶，并有指示燈指示值班氣瓶。當(dāng)主氣瓶中氣體用盡，裝置將自動啟用備用氣瓶供氣。切換器和主副氣瓶可以遠(yuǎn)離培養(yǎng)箱的位置布置，譬如安裝在細(xì)胞間外，通過專用氣路為一個或多個不同品牌、不同型號的三氣培養(yǎng)箱同時供氣。外置自動氣瓶切換器既可用培養(yǎng)箱原廠選件，也可以使用第三方產(chǎn)品，升級維護(hù)方便。

       當(dāng)然，無論是內(nèi)置、外置氣瓶自動切換器，都是為了確保箱體供氣的穩(wěn)定性，并不能解決氣體消耗量大的問題。而要切實(shí)降低三氣培養(yǎng)箱低氧實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中的N₂消耗開支，還得靠箱體配套的分割式氣密型內(nèi)門裝置。

3.2 分體式內(nèi)門

       既要確保低氧細(xì)胞實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中N2穩(wěn)定供應(yīng)，又要有效降低實(shí)驗(yàn)中N2消耗，這是眾多細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)者流量是指流體在單位時間內(nèi)通過某一橫斷面的容積（或重量），可用L/min標(biāo)示。流速是流體體通過截面積的速度。流體在一定時間內(nèi)通過特定截?cái)嗝娴捏w積與流體的速度和截?cái)嗝婷娣e成正比。

       細(xì)胞培養(yǎng)箱若采用傳統(tǒng)一體式單一內(nèi)門，則每次存取樣品開啟內(nèi)門后，整個機(jī)箱內(nèi)部全部暴露于實(shí)驗(yàn)室空氣中。箱體內(nèi)外氣體溫度和濃度差異懸殊，箱內(nèi)高溫氣團(tuán)迅速向外擴(kuò)散、向上蒸騰逃逸。溫度較低的空氣通過對流迅速流入，由下而上填充到箱內(nèi)的自由空間，完成對箱內(nèi)工作氣體的置換。機(jī)箱正面開孔尺寸大，相當(dāng)于發(fā)生氣流對流的截?cái)嗝婷娣e大，熱氣團(tuán)向外擴(kuò)散自然更快，損耗工作氣體容積越大。以普和希品牌三氣培養(yǎng)箱為例，MCO-50M箱內(nèi)正面截面的面積約1420cm2，而MCO-170M內(nèi)部截面面積約3250cm2，是前者之2.3倍。如限制箱內(nèi)外冷熱氣體對流通道截面面積，則可減少氣體對流的損耗。因此，人們在選擇三氣培養(yǎng)箱時，往往傾向于選擇Prescyto MG-71M、MCO-50M這類工作容積較小的機(jī)型。而對于多人共享培養(yǎng)箱服務(wù)平臺，小容量培養(yǎng)箱內(nèi)部工作空間有限。多個實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的不同實(shí)驗(yàn)樣品混雜，在操作中容易發(fā)生交叉污染。

       分體式內(nèi)門（Multiple-split inner door, or inner door with Multiple-segments），又稱分割式氣密性內(nèi)門（Gas Tight Screen Door），是替代傳統(tǒng)一體式玻璃內(nèi)門的密封裝置。每扇小門對應(yīng)于培養(yǎng)箱一個隔層空間，各小門獨(dú)立開合，互不干擾。存取樣品時，只需開啟其所在隔層對應(yīng)小門，而其它隔層的小門依然處于密閉狀態(tài)。因此，不會因少量樣品存取操作而將箱內(nèi)所有空間樣品暴露，箱內(nèi)氣體外泄發(fā)生被嚴(yán)格限制在局部范圍，有利于保持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，降低了N₂、CO₂、O₂和水蒸氣濃度大幅波動和氣體泄漏。理論上，內(nèi)門數(shù)量多，則樣品操作中箱內(nèi)培養(yǎng)氣體環(huán)境波動小。

       分體式內(nèi)門又分為一層一門和一層左右兩門兩款。eppendorf CellXpert C170i三氣培養(yǎng)箱有單一內(nèi)門型、4分內(nèi)門型和8分內(nèi)門型三種機(jī)型可選。8分內(nèi)門是在4分內(nèi)門結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，將每個小門進(jìn)一步劃分為左右兩扇小門而來，密閉防護(hù)效果比四分內(nèi)門更優(yōu)。再如Thermo HERAcell VIOS 160i三氣培養(yǎng)箱，內(nèi)部工作空間分為三個隔層，有單一內(nèi)門基礎(chǔ)款和配置3分內(nèi)門多人共享版。而蜂巢式HERAcell VIOS 160i三氣培養(yǎng)箱雖然也是三個隔層，但標(biāo)配6分式氣密內(nèi)門，將箱內(nèi)空間隔斷成6個獨(dú)立培養(yǎng)小室，可供6個實(shí)驗(yàn)者可自獨(dú)享一個小室。這樣還使不同樣品交叉污染風(fēng)險降低，方便共享管理。

       多屏分割式內(nèi)門可以在訂購三氣培養(yǎng)箱時作為O₂控制系統(tǒng)組件之一定制和工廠安裝，也可以在單一內(nèi)門使用中升級安裝。

       分體式內(nèi)門裝置降低的是開門操作工作氣體的損耗。但因每日經(jīng)箱體通氣口泄漏流失的氣體體積遠(yuǎn)大于箱門啟閉次數(shù)受控條件下所致?lián)p耗。因此，如要實(shí)現(xiàn)低氧培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中N₂供氣無憂管理，還得仰仗氮?dú)獍l(fā)生器幫忙。

3.3 氮?dú)獍l(fā)生器

       當(dāng)?shù)脱跖囵B(yǎng)箱內(nèi)部容積高達(dá)170L以上，或培養(yǎng)過程中需頻繁開門操作樣品，甚者實(shí)驗(yàn)室有2臺三氣培養(yǎng)箱在工作，則N₂的消耗將成為一項(xiàng)巨大管理支出。

       此外，對于儀器公共服務(wù)平臺，因不同O₂濃度控制條件下的低氧實(shí)驗(yàn)對CO₂、N₂消耗速度不同，傳統(tǒng)以儀器使用時長為依據(jù)的計(jì)費(fèi)服務(wù)管理方法就不合時宜。而引入氮?dú)獍l(fā)生器，可將N2消耗量差異的矛盾就轉(zhuǎn)變?yōu)榈獨(dú)獍l(fā)生器工作時長問題，對平臺和實(shí)驗(yàn)者雙方而言，都具有重大經(jīng)濟(jì)價值。

       LC-MS等諸多分析儀器運(yùn)行通常需要耗費(fèi)大量分析級高純度氮?dú)狻Ｓ脤?shí)驗(yàn)室氮?dú)獍l(fā)生器現(xiàn)場制氮而非氮?dú)怃撈繛長C-MS分析實(shí)驗(yàn)供氣，是全球多數(shù)分析儀器平臺的通行做法。

       氮?dú)獍l(fā)生器將室內(nèi)空氣經(jīng)多級過濾去除氣體中的灰塵顆粒和水分后，用空氣壓縮機(jī)將空氣泵入中空纖維膜濾除氧氣，即源源不斷產(chǎn)出99.99 - 99.999%純度的高純度氮?dú)狻?/span>

      發(fā)生器外形小巧，一鍵式操作啟動制氮。工作人員無需反復(fù)移動鋼瓶，無需負(fù)擔(dān)傳統(tǒng)N₂氣瓶運(yùn)輸和租賃成本，就解決了氣體穩(wěn)定供應(yīng)的問題。

       據(jù)已有測算數(shù)據(jù)，170L的三氣培養(yǎng)箱在5% O₂條件下連續(xù)運(yùn)行期間N2日消耗量約351L，而完成初始化所需輸入的N₂體積為400L。如要在20分鐘完成開機(jī)初始化過程，則此間N₂輸入流量須達(dá)到20.0 L/min。而穩(wěn)定運(yùn)行期間所需的N₂流量僅0.25L/min。低氧維持與開機(jī)初始化進(jìn)程所需輸入流量相差數(shù)十倍之多。
       無論國產(chǎn)進(jìn)口氮?dú)獍l(fā)生器，在產(chǎn)氣純度達(dá)到99.5%的工業(yè)N₂標(biāo)準(zhǔn)或99.99%《醫(yī)用氣體工程技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定N₂純度標(biāo)準(zhǔn)情況下，氮?dú)獍l(fā)生器的產(chǎn)氣流量與三氣培養(yǎng)箱開機(jī)初始化最大N₂輸入流量的匹配應(yīng)作為選型的主要參考指標(biāo)。

表4 三氣培養(yǎng)箱配套氮?dú)獍l(fā)生器技術(shù)規(guī)格實(shí)例

       表4的信息表明，日本TAITEC 公司所提供的N₂ GENESIS 200 + GST-0205M組合套裝，在N₂純度99.5%時最大輸出流量為3L/min，用于維持50 - 170L培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境維持5% O₂低氧水平是可行的。據(jù)測算，53L容積箱體在5% O₂設(shè)定條件下開機(jī)初始化進(jìn)程需N₂體積約130L，若要在30分鐘類完成則氮?dú)獍l(fā)生器有效氣體輸出流量至少應(yīng)達(dá)到4.4L/min。但這套氮?dú)獍l(fā)生器組合方案，視乎勉為其難。
       反觀日本PHCBi 公司的HF30氮?dú)獍l(fā)生器，其99.5%純度N₂輸出流速高達(dá)32L/min，完成MCO-170M三氣培養(yǎng)箱開機(jī)初始化所需400L氣體制備，耗時僅12.5分鐘，執(zhí)行效率相當(dāng)可觀。

       可見，50L容積三氣培養(yǎng)箱配套的氮?dú)獍l(fā)生器，99.5%純度N₂輸出流量應(yīng)》5L/min。170L容積箱體完成5% O₂濃度條件的初始化所需N₂輸出流量應(yīng)》14.1L/min，完成1% O₂條件初始化則要求N₂輸出流量》53.6L/min，則32L/min的輸出流量都顯得捉襟見肘。。
       通常，氮?dú)獍l(fā)生器系統(tǒng)的售價隨產(chǎn)氣流速增大而升高。在預(yù)算有限條件下，有效控制氮?dú)獍l(fā)生器系統(tǒng)造價和提升產(chǎn)氣流量兩種需求之間是矛盾的。而采用氮?dú)獍l(fā)生器配置壓縮氣瓶的方法，可一定程度上實(shí)現(xiàn)氮?dú)獍l(fā)生器流量成本控制與高峰期大流量N₂輸出需求兩個矛盾的平衡。將5-30L/min中小流量氮?dú)獍l(fā)生器+10-20L壓縮氣瓶組合后用于為三氣培養(yǎng)箱供氣，是較為理想的解決方案。

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